談補陽還五湯對腦缺血再灌注損傷大鼠PTEN mRNA 的影響論文

　　缺血性腦疾病主要是由于腦血供障礙，腦細胞功能喪失而引起的一系列神經(jīng)系統(tǒng)功能障礙性疾病。在腦中風事件中，有80% 由腦缺血造成中風后神經(jīng)功能缺失及死亡; 在我國，心腦血管病發(fā)病率居世界第二，其患病率、死亡率、致殘率居高難下，嚴重影響著人們的生活質(zhì)量和生活水平。補陽還五湯是目前治療腦卒中等血栓性疾病應用頻率最高的方劑，廣泛應用于防治缺血性腦血管病、冠心病、心肌梗死及其他血栓栓塞性疾病。補陽還五湯治療缺血性腦疾病療效確切，但其分子機制仍待進一步研究; 課題組前期研究發(fā)現(xiàn)補陽還五湯具有抗血小板的作用，同時，最新指南推薦在缺血性腦卒中的防治中應用抗血小板藥物，而第10 號染色體缺失的磷酸酶和張力蛋白同源物基因( PTEN)與P-選擇素( CD62P) 與血小板活化密切相關(guān)。因此，本文使用補陽還五湯預處理2 周后的SD 大鼠復制局灶性腦缺血再灌注模型，測定血漿中血小板活化標記物CD62P 含量及海馬組織中PTENmRNA 表達情況，探討補陽還五湯對抗腦缺血再灌注損傷的分子機制與血小板活化的關(guān)系。

　　1 材料

　　1. 1 動物

　　SPF 級SD 雄性大鼠60 只，體重250 ～300 g，廣東省醫(yī)學實驗動物中心提供，合格證號SCXK( 粵) 2013-0002。

　　1. 2 藥物與制劑

　　硫酸氫氯吡格雷片( 賽諾菲制藥有限公司，批號2A782) ，補陽還五湯顆粒劑水溶液按照《醫(yī)林改錯》所載的藥味用量進行制備。處方為: 生黃芪120 g，當歸尾6 g，赤芍4. 5 g，地龍、桃仁、紅花、川芎各3 g，( 黃芪顆粒劑，批號311001T;當歸顆粒劑，批號1307117; 赤芍顆粒劑，批號309081T; 地龍顆粒劑，批號1308206; 川芎顆粒劑，批號1308137; 桃仁顆粒劑，批號309127T; 紅花顆粒劑，批號1307190) ，取相當于飲片等量的各味藥顆粒劑( 由廣東一方制藥有限公司提供) 混合后，用100 ℃蒸餾水配制成補陽還五湯水溶液備用。

　　1. 3 儀器與試劑

　　ABI 7500 型熒光定量PCR 儀( 美國ABI 公司) ，Hema9600 型基因擴增儀( 珠海黑馬醫(yī)學儀器有限公司) ，1524R 型低溫冷凍離心機( 珠海黑馬醫(yī)學儀器有限公司) ， JS-power300 型電泳儀與培清JS-780 型全自動凝膠成像分析儀( 上海培清科技有限公司) ，K2800 型紫外核酸分析儀( 北京凱奧科技有限公司) 。CD62P 試劑盒( 華美生物公司，批號CSB-E07399r) ，SYBR K Premix Ex TaqTM( 日本TAKARA 公司，批號DRR420A) ，ReverseTranscriptase M-MLV 試劑盒( 日本TAKARA 公司，批號D2639A) ，Trizol ( 美國Invitrogen 公司，批號10296-010) ，CTAB( 美國BBI，批號CB0108) ，DEPC( 美國Sigma 公司，批號472565 ) ，瓊脂糖( Hydragene，批號R9012TAB) ，其余所需試劑由廣州化學制劑總廠提供。

　　2 方法

　　2. 1 動物分組使用隨機數(shù)字表法將60 只雄性SD 大鼠隨機分成5 組，每組12 只。即假手術(shù)組( 生理鹽水ig) 、模型組( 生理鹽水ig) 、氫氯吡格雷組( 6. 8 mg·kg - 1·d - 1 ) ，補陽還五湯高、低劑量組( 26，6. 5 g·kg - 1·d - 1 ) ，以上各組所用劑量均參照課題組前期實驗; 適應性飼養(yǎng)1 周后，再按照相應的藥物ig 給藥，每天2 次，連續(xù)2 周。

　　2. 2 局灶性腦缺血再灌注模型制作大鼠造模參照文獻的方法，采用大鼠大腦中動脈線栓法( MCAO) 復制局灶性腦缺血模型，并在造模前2 h給予相應藥物ig。大鼠10%水合氯醛( 1. 0 g·kg - 1 )ip 麻醉后，將大鼠固定于手術(shù)操作臺上，消毒后其余步驟參照文獻進行。假性手術(shù)組僅作皮膚切開和血管剝離，不做栓線處理，其余操作同其他組。造模完成后60 min 拔除栓線，待動物清醒后2 h 進行神經(jīng)功能評分。

　　2. 3 觀察指標

　　2. 3. 1 神經(jīng)行為評分動物于清醒后2 h 參照文獻進行神經(jīng)行為評分。評分標準如下: 0 分無神經(jīng)損傷癥狀; 1 分不能完全伸展對側(cè)前爪; 2 分向?qū)��?cè)轉(zhuǎn)圈; 3 分向?qū)��?cè)傾倒; 4 分不能自發(fā)行走，意識喪失。

　　2. 3. 2 檢測血漿CD62P 含量拔除栓線再灌注12 h后大鼠經(jīng)10%水合氯醛ip 麻醉( 1. 0 g·kg - 1 ) ，眼眶取血約2 mL 置于真空肝素鈉抗凝管中，4℃，3 000 r·min - 1，離心30 min，吸取血漿，放置于- 20 ℃冰箱，備測。采用酶聯(lián)免疫定量檢測技術(shù)檢測大鼠血漿CD62P 的含量; 操作過程均嚴格按照試劑說明書進行。

　　2. 3. 3 測定海馬組織PTEN mRNA 表達拔除栓線再灌注12 h 后大鼠經(jīng)10% 水合氯醛ip 麻醉( 1. 0g·kg - 1 ) ，生理鹽水灌洗，4%多聚甲醛固定后迅速取腦組織，分離海馬，用RNA later 溶液預處理海馬組織。Trizol 法進行總RNA 提取海馬組織總RNA，并進行純度分析。引物設計與合成由廣州貝奧吉因生物科技有限公司完成，PTEN 與內(nèi)參基因引物序列詳見表1。RNA 反轉(zhuǎn)錄與擴增嚴格按照試劑盒說明進行;反應結(jié)束后，確認Real-Time PCR 的擴增曲線和熔解曲線，由電腦自動分析并計算出反應體系中待測樣本cDNA 達到設定閾值的循環(huán)數(shù)( cycle count，Ct) 。實驗中各個樣本均做2 個復孔。以假手術(shù)組做對照，使用2 - ΔΔCt值計算mRNA 相對表達情況。2. 4 統(tǒng)計學方法采用SPSS 19. 0 統(tǒng)計軟件，結(jié)果均以珋x ± s 表示，等級資料比較采用Kruskal-Wallis檢驗，計量資料比較采用單因素方差分析檢驗和方差齊性檢驗，組間數(shù)據(jù)采用LSD-t 檢驗或者Nemenyi檢驗( 非參數(shù)檢驗兩兩比較) ，以P < 0. 05 為差異有統(tǒng)計學意義。

　　3 結(jié)果

　　3. 1 對神經(jīng)行為評分的影響與假手術(shù)組比較，模型組的神經(jīng)行為評分顯著升高; 與模型組比較，補陽還五湯與氫氯吡格雷均能明顯降低大鼠神經(jīng)行為評分( P < 0. 01)。

　　3. 2 對血漿CD62P 含量的影響與假手術(shù)組比較，模型組血漿中CD62P 表達顯著升高( P < 0. 05) ; 與模型組比較，補陽還五湯高劑量組與氫氯吡格雷組均能顯著抑制血漿中CD62P 表達( P < 0. 05)。

　　3. 3 對海馬組織中PTEN mRNA 表達的影響與假手術(shù)組比較，模型組海馬組織中PTEN mRNA 表達顯著升高( P < 0. 05) ; 與模型組比較，補陽還五湯與氫氯吡格雷均能下調(diào)海馬組織PTEN mRNA 的病理性過表達( P < 0. 05)。

　　4 討論

　　腦血管疾病為臨床常見病，由于其病死率高，國內(nèi)外在臨床治療上仍主要推薦以阿司匹林預防為主，但10 年前有學者發(fā)現(xiàn)阿司匹林與氫氯匹格雷在腦缺血疾病防治中出現(xiàn)了無應答狀況，因此，尋找類似抗血小板藥物迫在眉睫。近年研究發(fā)現(xiàn)補陽還五湯具有抗血小板活化、神經(jīng)保護、抗氧化、抗炎等作用，在臨床抗腦缺血治療中應用廣泛; 尹天雷通過原位雜交實驗發(fā)現(xiàn)補陽還五湯能上調(diào)磷脂酰肌醇3 激酶/蛋白激酶B( PI3K/AKT) 陽性細胞表達，其抗腦缺血作用與調(diào)節(jié)PI3K/AKT信號轉(zhuǎn)導表達有關(guān)。PTEN 基因是具有蛋白酯酶與磷酸酶雙重生物活性的抑癌基因，能夠使PI3K 產(chǎn)生的第二信使去磷酸化，進而調(diào)節(jié)PI3K/AKT 信號通路，干預細胞凋亡過程進而起到神經(jīng)保護作用。本文研究亦發(fā)現(xiàn)在缺血預處理中，補陽還五湯神經(jīng)保護作用與下調(diào)PTEN 基因有關(guān)。另外，Weng Z 等研究發(fā)現(xiàn)PTEN 基因缺失會導致血小板數(shù)目增多、出血時間縮短，患者易于栓塞，即PTEN 基因參與了血小板激活過程; 不僅如此，PTEN 基因還可通過調(diào)節(jié)PI3K/AKT 信號通路調(diào)節(jié)細胞炎癥通路進而減輕腦組織炎癥反應。

　　此外，CD62P 亦可通過與白細胞相互作用參與炎癥反應等過程。因此，本文選用血小板活化標記物CD62P 檢測血小板活化情況，并在神經(jīng)功能評分基礎上檢測了PTEN mRNA 表達情況，探討補陽還五湯對抗腦缺血再灌注損傷與血小板活化的內(nèi)在關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)補陽還五湯預處理能抑制血小板活化并顯著降低模型大鼠的神經(jīng)功能評分，其作用效果與氯匹格雷相似，提示補陽還五湯預處理的神經(jīng)保護作用可能與其抑制血小板活化有關(guān); 另外還發(fā)現(xiàn)腦缺血后血小板大量激活，PTEN 基因過度表達，易于出現(xiàn)腦梗后再出血并發(fā)癥，而補陽還五湯能通過下調(diào)過表達的PTEN 基因而干預PI3K/AKT 信號通路，進而在調(diào)節(jié)細胞凋亡與血小板活化的同時，減輕炎性反應造成的組織損傷，表明補陽還五湯神經(jīng)保護機制可能與下調(diào)PTEN 基因過表達及抑制CD62P表達有關(guān)，而其主要機制可能通過調(diào)節(jié)PI3K/AKT信號通路，未來筆者將進一步研究補陽還五湯對PI3K/AKT 信號通路的其他靶點基因的影響。

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