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肝纖維化是持續(xù)性肝臟損傷的共同病理改變過程，主要表現(xiàn)為細胞外基質(extracellularmatrix，ECM)在肝臟中的大量沉積，其持續(xù)發(fā)展可形成肝硬化和肝細胞癌。肝纖維化的形成機制目前尚不清楚，研究表明肝星狀細胞(hepaticstellatecell，HSC)的增殖活化是肝纖維化形成的關鍵，抑制HSC的增殖活化成為防治肝纖維化的重點。有文獻報道，Zeste基因增強子同源物2(enhancerofzestehomolog2，EZH2)在纖維化形成中起重要作用。肝纖維化形成過程中，MAPK/ERK和PI3K/AKT通路被激活并起重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，EZH2能夠激活MAPK/ERK 和PI3K/AKT通路，從而引起疾病。本研究擬應用EZH2的抑制劑DZNep和小干擾RNA(smallinterferingRNA，siRNA)抑制EZH2的表達，考察其對HSC增殖活化的調控作用，探究其調控機制，以期為肝纖維化的防治提供新的靶點。
1 材料
1.1 細胞株
大鼠肝星狀細胞株HSC睺6購于南京凱基生物科技發(fā)展有限公司。
1.2 試劑與儀器
DZNep購于Selleckchem公司;TGFβ1購于Peprotech公司;噻唑藍MTT購于Sig瞞a公司;DMSO購于Sigma公司;胰蛋白酶、DMEM培養(yǎng)基為Hyclone公司產品;胎牛血清購于杭州四季青公司;山羊抗小鼠IgG和山羊抗兔IgG購于北京中杉金橋生物技術有限公司;脂質體Lipofectami瞡eTM 2000、Opti睲EM購于Invitrogen公司;EZH2、p睧RK、ERK、p睞KT和AKT抗體購于CellSignaling公司;α睸MA抗體購于北京博奧森生物技術有限公司;β瞐ctin抗體購于北京中杉金橋生物技術有限公司;倒置熒光顯微鏡(OLYMPUS公司，日本);酶標儀(bio瞭ekEL)。
2 方法
2.1 HSC睺6細胞的培養(yǎng)
應用含10% 胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，在37℃、5% CO2 及飽和濕度條件下進行細胞培養(yǎng)，待細胞長至70% ～80% 密度時進行細胞傳代。
2.2 DZNep的應用
加入DZNep24h前，將細胞傳代至6孔培養(yǎng)板，每孔2x105細胞。實驗分正常組、應用TGFβ1刺激的模型組、TGFβ1刺激并加入DZNep的恢復組。正常組不做任何處理;模型組加入TGFβ1刺激終濃度為10μg· L-1，TGFβ1作用于細胞的時間為48h;恢復組加入TGFβ1刺激終濃度為10μg· L-1，并加入DZNep刺激終濃度為1μmol· L-1，DZNep作用于細胞的時間為24h。
2.3 siRNA的合成
根據siRNA設計原則，設計針對EZH2基因的siRNA序列，在GenBank表達序列標簽(EST)數(shù)據庫應用BLAST檢索，并確認所設計siRNA序列的唯一性，靶向目的基因EZH2的序列設計的兩條鏈，正義鏈：5′睪GGCAUCUUUAU睠AAAGAUTT3′;反義鏈：5′睞UCUUUGAUAAAGAUGCCCTT3′。同樣方法構建陰性對照組的兩條鏈，正義鏈：5′睻UCUCCGAACGUGUCACGUTT3′;反義鏈：5′睞CGUGACACGUUCGGAGAATT3′，與任何編碼序列無同源性，由吉瑪制藥有限公司合成有效siRNA干粉制劑。細胞培養(yǎng)及siRNA轉染HSC睺6細胞培養(yǎng)于含10% 胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，37℃、5% CO2 培養(yǎng)。轉染24h前，傳代至6孔培養(yǎng)板，每孔2x105細胞。實驗分正常組、模型組、陰性對照組和EZH2瞫iRNA實驗組。正常組不做任何處理;模型組加入TGFβ1;陰性對照組轉染FAM標記的陰性對照siR睳A并加入TGFβ1;實驗組轉染EZH2瞫iRNA并加入TGFβ1。用Opti睲EM和脂質體作為轉染試劑進行轉染，使siRNA終濃度均為100pmol· L-1，置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱轉染6h后，每組加入完全培養(yǎng)基含TGFβ1使刺激終濃度為10μg· L-1，繼續(xù)培養(yǎng)48h，收獲細胞。采用熒光倒置顯微鏡觀察各組轉染后的細胞形態(tài)并判斷轉染效果。
2.4 細胞增殖實驗
以MTT法檢測HSC睺6細胞的增殖，分組同上。將培養(yǎng)的HSC睺6細胞以10%胎牛血清的DMEM制備成1x108· L-1的細胞懸液，接種于96孔板，每孔100μL，過夜，待細胞貼壁后進行細胞轉染，轉染后6h換液，每孔加入完全培養(yǎng)基200μL含TGFβ1使刺激終濃度為10μg·L-1，37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)12、24、48、72h，然后每孔加05% MTT貯存液20μL繼續(xù)孵育4h，最后棄上清，每孔加入150μL二甲基亞砜溶解細胞內結晶，置于恒溫震蕩器上震搖10min，應用酶標儀于490nm波長處測定吸光度值，以空白對照組作為對照組，其細胞存活率為100%，其余各組按：存活率/% =[(各實驗組吸光度值脖鏡孜光度值)/(對照組吸光度值-本底吸光度值)]x100%。
2.5 Westernblot檢測EZH2、p睧RK、p睞KT、α睸MA蛋白表達
細胞的培養(yǎng)、分組、處理同上。DZNep作用24h或者轉染EZH2瞫iRNA48h后，分別提取細胞總蛋白，應用BCA法測定蛋白濃度。應用10% SDS睵AGE凝膠進行電泳，在200mA恒定電流下應用PVDF膜進行轉膜，TBST洗膜后，使用5% 牛奶封閉非特異性結合位點，TBST洗膜后，在4℃于一抗(1∶500)中孵育過夜，TBST洗膜后，加入辣根過氧化物酶標記的山羊抗小鼠或抗兔二抗(1∶10000)室溫中孵育1h，TBST洗膜后，加入ECL發(fā)光劑反應20s，電腦顯影成像，實驗重復3次或以上。
2.6 統(tǒng)計學處理
采用SPSS130軟件進行統(tǒng)計分析，數(shù)據以珋x±s表示。兩組間比較采用t檢驗，多__組間比較采用單因素方差分析。
3 結果
3.1 Westernblot法檢測應用DZNep后HSC睺6細胞中EZH2、p睧RK、p睞KT和α睸MA蛋白表達變化 加入TGFβ1的模型組EZH2蛋白表達水平明顯升高，與正常組相比差異有顯著性(P<001)，加入TGFβ1和DZNep的恢復組EZH2蛋白表達水平明顯降低，與模型組相比差異有顯著性(P<001)，見Fig1A;同時，模型組p睧RK和p睞KT蛋白表達水平明顯升高，與正常組相比差異有顯著性(P<001)，恢復組p睧RK和p睞KT蛋白表達水平明顯降低，與模型組相比差異有顯著性(P<001)，見Fig1B;與此同時，模型組α睸MA蛋白表達水平明顯升高，與正常組相比差異有顯著性(P<001)，恢復組α睸MA蛋白表達水平明顯降低，與模型組相比差異有顯著性(P<001)，見Fig1C。
3.2 MTT法檢測HSC睺6增殖活性 MTT實驗結果顯示，EZH2瞫iRNA瞬時轉染對TGFβ1誘導的HSC睺6細胞的增殖有明顯的抑制作用，EZH2瞫iR睳A實驗組作用12h細胞抑制率與陰性對照組、模型組之間差異無顯著性(P>005);EZH2瞫iRNA實驗組作用24、48、72h細胞抑制率明顯高于陰性對照組、模型組(P<005)。同時，作用24、48、72h時模型組、陰性對照組與正常組之間差異有顯著性(P<005)，見Fig2。
3.3 Westernblot法檢測siRNA轉染后HSC睺6細胞中EZH2、p睧RK、p睞KT和α睸MA蛋白表達變化 瞬時轉染EZH2瞫iRNA48h后，EZH2蛋白表達明顯降低，與陰性對照組相比差異有顯著性(P<001)，陰性對照組、模型組與正常組相比差異亦有顯著性(P<001)，見Fig3A;同時，EZH2瞫iRNA實驗組p睧RK和p睞KT蛋白表達也明顯降低，與陰性對照組相比差異有顯著性(P<001)，陰性對照組、模型組與正常組相比差異亦有顯著性(P<001)，見Fig3B;與此同時，EZH2瞫iRNA實驗組α睸MA蛋白表達也明顯降低，與陰性對照組相比差異有顯著性(P<001)，陰性對照組、模型組與正常組相比差異亦有顯著性(P<001)，見Fig3C。
4 討論
HSC的增殖活化是肝纖維化發(fā)生發(fā)展的關鍵環(huán)節(jié)，抑制HSC的增殖活化成為預防和治療肝纖維化的重要手段之一。近些年研究發(fā)現(xiàn)，表觀遺傳學(包括DNA甲基化、microRNA和組蛋白修飾等)在肝纖維化的發(fā)生發(fā)展中扮演重要角色。組蛋白修飾是指在組蛋白相關酶的作用下，組蛋白發(fā)生乙�；�、磷酸化、甲基化和泛素化等修飾的過程。組蛋白的甲基化修飾是由組蛋白甲基轉移酶來實現(xiàn)的，組蛋白的甲基化可發(fā)生在組蛋白的賴氨酸和精氨酸殘基上，最終可導致基因的轉錄沉默或轉錄激活。研究發(fā)現(xiàn)，組蛋白的甲基化修飾與HSC的狀態(tài)及轉歸密切相關。EZH2是一個重要的組蛋白甲基轉移酶，通過特異性甲基化基因啟動子區(qū)域組蛋白H3賴氨酸27，廣泛參與了基因的轉錄沉默。在癌癥的發(fā)生發(fā)展中，EZH2被認為是一個促癌基因，在子宮內膜癌、前列腺癌、肝癌等惡性腫瘤中高表達。有研究發(fā)現(xiàn)，EZH2在肝纖維化形成中扮演重要角色，但是其具體機制尚不清楚。
有文獻報道，在生長因子TGFβ1等的刺激下，MAPK/ERK和PI3K/AKT信號通路被激活，進而影響到大鼠肝星狀細胞HSC睺6的增殖活化。有研究發(fā)現(xiàn)，EZH2能夠激活MAPK/ERK和PI3K/AKT信號通路從而引起疾病的發(fā)生。那么EZH2能否影響TGFβ1誘導的HSC的增殖活化，EZH2通過何種機制影響其增殖活化，目前尚未見文獻報道。在該項研究中，應用TGFβ1誘導HSC增殖活化，同時應用EZH2的抑制劑DZNep和siRNA技術，抑制HSC睺6中EZH2的表達，觀察EZH2表達下調后對TGFβ1誘導的HSC增殖活化的影響，及其對MAPK/ERK和PI3K/AKT信號通路的影響。應用EZH2的小干擾RNA后，與陰性對照組比較，EZH2瞫iRNA實驗組EZH2蛋白表達水平明顯降低，表明瞬時轉染實驗成功。MTT法是評估細胞增殖的一種有效方法，MTT的結果表明，通過siRNA沉默EZH2的表達可明顯抑制TGFβ1誘導的HSC睺6細胞的增殖。α睸MA是HSC活化的特征性標志，Westernblot檢測結果顯示，應用抑制劑DZNep后，可明顯降低α睸MA蛋白的表達;靶向干擾HSC睺6細胞中EZH2的表達，可明顯降低α睸MA蛋白的表達。表明抑制EZH2的表達能影響TGFβ1誘導的HSC的增殖活化。結果進一步表明，應用TGFβ1刺激HSC睺6細胞可明顯升高EZH2蛋白表達水平，也可明顯升高p睧RK、p睞KT蛋白表達水平。應用抑制劑DZNep后可明顯降低EZH2蛋白表達水平，也可明顯降低p睧RK和p睞KT蛋白表達水平。靶向干擾HSC睺6細胞中EZH2基因的表達，可明顯降低EZH2蛋白表達水平，也可降低p睧RK和p睞KT蛋白表達水平。表明抑制EZH2的表達能影響TGFβ1誘導的HSC中MAPK/ERK和PI3K/AKT信號通路的激活。抑制EZH2的表達能影響MAPK/ERK和PI3K/AKT信號通路的激活，是影響TGFβ1誘導的HSC增殖活化的機制。
綜上，抑制HSC睺6細胞中EZH2基因的表達，能影響TGFβ1誘導的HSC 中MAPK/ERK 和PI3K/AKT信號通路的激活，從而抑制HSC的增殖活化。本研究從細胞分子水平闡明EZH2對HSC的增殖活化的調控作用及其可能的潛在調控機制。揭示了EZH2在肝纖維化發(fā)展中的重要作用，可能成為防治肝纖維化的潛在新靶點，還需要通過其它實驗進一步驗證。肝纖維化的形成過程非常復雜，EZH2如何調控基因的沉默，尚需進一步深入研究。
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