組合添加代謝調(diào)控劑對(duì)肌苷發(fā)酵及其代謝流分布的影響分析論文
1引言
肌苷又稱次黃嘌呤核苷，它在食品和醫(yī)藥等領(lǐng)域有著廣泛的用途.肌苷是食品工業(yè)中肌苷酸的原料，同時(shí)也是各種調(diào)味食品的營養(yǎng)助鮮劑;在醫(yī)藥上，肌苷能預(yù)防及解除由血防藥物引起的對(duì)心臟或肝臟的副作用，是治療冠心病、肝炎、白血球減少癥等的良效藥物。
通過研究細(xì)胞代謝流的動(dòng)態(tài)變化，對(duì)發(fā)酵過程進(jìn)行優(yōu)化是目前研究的熱點(diǎn)。而根據(jù)細(xì)胞生長和產(chǎn)物合成的代謝調(diào)控機(jī)理，添加代謝調(diào)控劑對(duì)代謝過程進(jìn)行調(diào)控，成為增加產(chǎn)物產(chǎn)量的有效方式。發(fā)現(xiàn)添加檸檬酸可以減小糖酵解途徑(EMP)的代謝通量，同時(shí)增大磷酸戊糖途徑(HMP)和三梭酸循環(huán)(TCA)的代謝通量，從而造成核糖合成代謝流的增加，使糖產(chǎn)量得到顯著提高。劉新星等在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加0.2 g的檸檬酸鈉，使糖酵解途徑中磷酸果糖激酶和丙酮酸激酶的活力降低，從而減弱了糖酵解途徑的通量，肌苷產(chǎn)量提高了18%。陳雙喜等在肌苷搖瓶發(fā)酵過程中添加10 g，的葡萄糖酸鈣，能夠誘導(dǎo)葡萄糖酸激酶的生成，增大磷酸戊糖途徑的代謝通量，肌苷-產(chǎn)率由10.76 g提高到18.36 g。
對(duì)于肌苷生產(chǎn)來說，糖酵解途徑代謝流的減弱會(huì)導(dǎo)致代謝流在EMP途徑、HMP途徑和TCA循環(huán)之間的重新分配，使更多的碳源轉(zhuǎn)向HMP途徑，從而為肌苷的合成提供更多的前體。因此，只要添加對(duì)代謝途徑關(guān)鍵酶具有特定調(diào)控作用的代謝調(diào)控劑，就可以有效地增加肌苷的發(fā)酵產(chǎn)量。不過，在發(fā)酵過程單一添加一種代謝調(diào)控劑，僅針對(duì)肌苷，生物合成過程中的一種或少數(shù)幾種關(guān)鍵酶進(jìn)行調(diào)節(jié)，其他的限制肌苷，合成的調(diào)控節(jié)點(diǎn)并沒有得到改善。而如果在發(fā)酵過程中組合添加代謝調(diào)控劑，使多個(gè)關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)同時(shí)得到有效調(diào)控，有可能使肌苷產(chǎn)量得到進(jìn)一步的提高，這方而的研究還未見報(bào)道。因此，木實(shí)驗(yàn)根據(jù)肌苷-的合成機(jī)理，選擇對(duì)肌苷，生物合成過程具有特定調(diào)控作用的代謝調(diào)控劑，在考察單一添加代謝調(diào)控劑對(duì)肌苷生物合成影響的基礎(chǔ)上，組合添加這些代謝調(diào)控劑，對(duì)肌苷生物合成過程的多個(gè)關(guān)鍵代謝調(diào)控節(jié)點(diǎn)進(jìn)行調(diào)控，增大流向肌苷合成的代謝流，使肌苷產(chǎn)量得到顯著提升。進(jìn)而利用代謝通量分析的方法，對(duì)組合添加代謝調(diào)控劑提高肌苷產(chǎn)量的代謝調(diào)控機(jī)理進(jìn)行深入分析。
2結(jié)果與討論
2.1單一代謝調(diào)控劑的選擇及其對(duì)肌苷發(fā)酵的影響
相關(guān)研究表明，在發(fā)酵過程添加檸檬酸鈉或葡萄糖酸鈣，可以對(duì)6-磷酸果糖激酶、丙酮酸激酶或葡萄糖酸激酶等代謝途徑中的關(guān)鍵酶進(jìn)行調(diào)節(jié)，抑制EMP途徑并增大HMP途徑的代謝通量，引起代謝流朝向有利于肌苷-合成的方向遷移。在初始培養(yǎng)基中分別添加不同濃度的檸檬酸鈉或葡萄糖酸鈣，檢測(cè)發(fā)酵肌苷產(chǎn)量和生物量。
適量添加檸檬酸鈉可以提高枯草芽抱桿菌的肌苷產(chǎn)量。其中，在培養(yǎng)基中添加3 g檸檬酸鈉，肌苷產(chǎn)量比對(duì)照組增加13.9%。檸檬酸和葡萄糖的聯(lián)合代謝可增加C a2的吸收，對(duì)丙酮酸激酶產(chǎn)生強(qiáng)烈抑制，造成磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)的累積，PEP是磷酸果糖激酶的強(qiáng)烈抑制劑，丙酮酸激酶和磷酸果糖激酶是EMP途徑的關(guān)鍵酶，造成EMP途徑通量減弱，導(dǎo)致更多的碳源進(jìn)入HMP途徑。
在培養(yǎng)基中添加葡萄糖酸鈣，肌苷發(fā)酵產(chǎn)量比對(duì)照組增加27.8%。在枯草桿菌中，少量葡萄糖經(jīng)葡萄糖脫氫酶生產(chǎn)葡萄糖酸，然后在葡萄糖酸激酶的作用下生成6-磷酸-葡萄糖酸，進(jìn)入HMP途徑，加入葡萄糖酸鈣可以大幅度提高葡萄糖酸激酶的比活，增大HMP途徑的通量，一方而促進(jìn)菌體合成，另一方而為肌苷合成提供較多的前體物質(zhì)，提高肌苷的產(chǎn)率。
根據(jù)類似的調(diào)節(jié)機(jī)理，選擇烯醇化酶抑制劑、酸酶激活劑、和肌苷合成的前體次黃嘌呤核苷等三種代謝調(diào)控劑，分別考察其不同的的添加量對(duì)肌苷合成的影響。
適量的添加NaF對(duì)肌苷產(chǎn)量具有顯著的提高作用，當(dāng)添加2 mg時(shí)，肌苷產(chǎn)量比對(duì)照組提高了23.9% 。因此，添加適量的NaF可以減弱糖酵解途徑通量，使更多的糖進(jìn)入HMP途徑為肌苷的生物合成提供更多的前體，從而提高了肌苷產(chǎn)量。
適量添加氯化鈣對(duì)枯草芽抱桿菌的生長以及肌苷-的積累均有一定的促進(jìn)作用。其中，當(dāng)添加5 mg，的CaClz時(shí)，生物量可以達(dá)到最大值;而當(dāng)加入10 mg，的C aC 1z時(shí)，肌苷產(chǎn)量達(dá)到最大值，比對(duì)照組的肌苷-產(chǎn)量高出了23.1%。這主要是因?yàn)镃aCI的添加可以提高。酸酶的活力，而酸酶是肌苷合成途徑中的關(guān)鍵酶，酸酶活力的增加有助于肌苷的積累，因此CaCI的適量添加有助于肌苷產(chǎn)量的`提高。
添加適量的次黃嘌呤核苷對(duì)枯草芽抱桿菌的生長沒有明顯的促進(jìn)作用，但對(duì)肌苷產(chǎn)量的積累卻有顯著地提高作用，尤其當(dāng)添加0.15%次黃嘌呤核苷時(shí)，肌苷產(chǎn)量比對(duì)照組提高了89.9%，這與次黃嘌呤核苷，合成途徑的前體物質(zhì)有關(guān)，加入的次黃嘌呤核苷為枯草芽抱桿菌提供了完整的吟環(huán)，從而使得枯草芽抱桿菌便于通過補(bǔ)救途徑大量合成肌苷。
2.2組合添加代謝調(diào)控劑對(duì)肌苷發(fā)酵的影響
針對(duì)肌苷，合成過程的代謝調(diào)控節(jié)點(diǎn)，在發(fā)酵過程分別添加NaF、次黃嘌呤核苷、葡萄糖酸鈣、C aC 1z和檸檬酸鈉等五種代謝調(diào)控劑，使代謝流朝向有利于肌苷-合成的方向，可以有效地提高發(fā)酵過程的肌苷，產(chǎn)量。不過，在發(fā)酵過程單一添加一種代謝調(diào)控劑，僅針對(duì)肌苷，生物合成過程中的少數(shù)節(jié)點(diǎn)進(jìn)行調(diào)控，其他的限制肌苷，合成的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)并沒有得到改善。因此，在發(fā)酵過程中組合添加這五種代謝調(diào)控劑，同時(shí)對(duì)肌苷，合成的多個(gè)關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)進(jìn)行調(diào)控，以使肌苷-合成的代謝流得到進(jìn)一步的增大，促進(jìn)肌苷產(chǎn)量的進(jìn)一步提高。
2.3組合添加代謝調(diào)控劑對(duì)肌苷發(fā)酵影響的代謝通量分析
在進(jìn)行代謝通量分析時(shí)，主要針對(duì)枯草芽抱桿菌發(fā)酵中后期這段時(shí)間進(jìn)行代謝通量分析，因?yàn)樵撾A段肌苷，的積累速率達(dá)到最大，同時(shí)細(xì)胞的生長處于穩(wěn)定期，此時(shí)關(guān)于細(xì)胞代謝過程的擬穩(wěn)態(tài)假設(shè)更接近成立。
以上這些結(jié)果表明，減弱EMP途徑的代謝流量以及增大HMP途徑的代謝流量，可以促進(jìn)肌苷合成。
單一添加代謝調(diào)控劑，僅針對(duì)一個(gè)或少數(shù)幾個(gè)節(jié)點(diǎn)進(jìn)行調(diào)控，葡萄糖代謝流在各分支途徑中的分配遠(yuǎn)未達(dá)到最佳，肌苷產(chǎn)量提高有限。相比之下，在發(fā)酵過程組合添加不同的代謝調(diào)控劑，可以同時(shí)對(duì)多個(gè)代謝調(diào)控節(jié)點(diǎn)進(jìn)行調(diào)控，使得葡萄糖代謝流由EMP途徑向HMP途徑發(fā)生較大程度的遷移，實(shí)現(xiàn)對(duì)葡萄糖主體代謝流分布的調(diào)整，促使肌苷的產(chǎn)率得到顯著的提高。
3結(jié)論
根據(jù)枯草芽抱桿菌生物合成肌苷的代謝調(diào)控機(jī)理，選擇五種有利于肌苷積累的代謝調(diào)控劑: 次黃嘌呤核苷、葡萄糖酸鈣、檸檬酸鈉。在培養(yǎng)基中組合添加這些代謝調(diào)控劑時(shí)，肌苷產(chǎn)量得到進(jìn)一步提高，當(dāng)組合添加2 mg，0.15%次黃嘌呤核苷、15 g葡萄糖酸鈣和10mgCaClz時(shí)，肌苷-的產(chǎn)量達(dá)到了14.01 g，相比不添加代謝調(diào)控劑的空白對(duì)照組肌苷產(chǎn)量增加了3.39倍。對(duì)代謝網(wǎng)路各分支途徑的代謝通量變化進(jìn)行測(cè)定，從代謝調(diào)控的角度確證了組合添加代謝調(diào)控劑，針對(duì)多個(gè)代謝調(diào)控節(jié)點(diǎn)進(jìn)行調(diào)控，可以實(shí)現(xiàn)葡萄糖代謝流中各分支途徑的合理分配，促使發(fā)酵過程的葡萄糖代謝流由EMP途徑向HMP途徑發(fā)生遷移，肌苷產(chǎn)量得到顯著提升。
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