醫(yī)學(xué)研究課題開題報告
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立題依據(jù)(科學(xué)意義及國內(nèi)外現(xiàn)狀分析及參考文獻(xiàn))
惡性黑色素瘤是一種高度惡性且最具侵襲性的癌之一，多發(fā)生于皮膚，早期發(fā)生血行轉(zhuǎn)移。對放、化療不敏感，在世界范圍內(nèi)發(fā)病率增高，人們一直在期待著可以征服惡性黑素瘤的新的療法的出現(xiàn)!
最近大量的數(shù)據(jù)表明惡性腫瘤的發(fā)展與T-鈣粘蛋白的表達(dá)變化相關(guān).T-鈣粘蛋白已在乳腺癌、前列腺癌、肝癌、肺癌、胃癌、胰腺癌、卵巢癌等多種惡性腫瘤中被檢測到表達(dá)減少.最近的研究表明T/H 鈣粘蛋白在乳腺癌中的重新表達(dá)能抑制腫瘤細(xì)胞的生長,降低體外培養(yǎng)的`腫瘤細(xì)胞的侵襲潛能.T/H 鈣粘蛋白這個新型鈣粘蛋白分子在人類許多癌細(xì)胞中表達(dá)都降低表明它或許在腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移及維持正常細(xì)胞的表型中起重要作用.
T/H 鈣粘蛋白與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有著密切的聯(lián)系,也許它會為腫瘤的診斷和治療帶來新的契機(jī).
T-鈣粘蛋白是否對惡性黑色素瘤也有作用，目前還沒有相關(guān)研究的報道，所以本實驗將進(jìn)行相關(guān)方面的探討性研究!
研究內(nèi)容及預(yù)期成果(說明具體研究內(nèi)容、創(chuàng)新點(diǎn)及擬解決的關(guān)鍵問題、預(yù)期成果及提供形式)
研究內(nèi)容：
第一部分：正常表皮組織、痣細(xì)胞及黑色素瘤細(xì)胞中T-cadherin表達(dá)情況
第二部分 T-cadherin基因克隆和真核表達(dá)載體的構(gòu)建
第三部分：T-cadherin基因的真核表達(dá)及生物活性分析
創(chuàng)新點(diǎn)：首次將T-cadherin基因轉(zhuǎn)染黑素瘤細(xì)胞
擬解決的關(guān)鍵問題：通過RT-PCR反應(yīng)擴(kuò)增出T-cadherin的基因全長。
預(yù)期成果及提供形式：
觀察T-鈣粘蛋白在正常皮膚組織細(xì)胞、痣細(xì)胞及黑色素瘤細(xì)胞中的表達(dá)情況!
進(jìn)一步闡明T-鈣粘蛋白作用機(jī)制
T-鈣粘蛋白基因轉(zhuǎn)染入黑色素瘤細(xì)胞后觀察對其增殖和轉(zhuǎn)移活性的抑制情況，探索臨床診斷和治療黑色素瘤及其它腫瘤的方法!
研究方案(包括研究方法、技術(shù)路線、研究進(jìn)度安排)
研究方法：
第一部分：正常表皮組織、痣細(xì)胞及黑色素瘤細(xì)胞中T-cadherin表達(dá)情況
免疫組織化學(xué)和免疫細(xì)胞化學(xué)
材料：從正常人皮膚切取的痣組織，人黑色素瘤細(xì)胞株
主要試劑和溶液
(1)第一抗體：兔抗人T-cadherin 抗體
(2)第二抗體：生物素標(biāo)記羊抗兔IgG
(3) 三抗 ：鏈親和霉素標(biāo)記HRP
設(shè)備方法
(1)冷凍切片的免疫染色程序
(2)活細(xì)胞的免疫染色程序
熒光顯微鏡檢
注意：為保證結(jié)果的可靠性應(yīng)該同時設(shè)有對照
陽性對照(正常組織) ;
陰性對照(PBS代替一抗)以證明抗體的特異性。
第二部分 T-cadherin基因克隆和真核表達(dá)載體的構(gòu)建
材料：
(1)組織和細(xì)胞
(2)菌株與質(zhì)粒
(3)工具酶
(4)試劑
(5)儀器
方法
(1)引物的設(shè)計
(2)總RNA的提取：異硫氰酸胍-酚-氯仿抽提一步法
(3)甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳分析其質(zhì)量，觀察所提RNA有無明顯降解;
(4)逆轉(zhuǎn)錄RT反應(yīng) ：為了證實RT反應(yīng)的成功設(shè)管家基因GAPDH為內(nèi)對照
(5)PCR擴(kuò)增 ：利用上下游引物，在DNA聚合酶下對目的片段進(jìn)行擴(kuò)增，PCR過程設(shè)β-actin為內(nèi)對照
(6)PCR產(chǎn)物的回收、純化
(7)PCR產(chǎn)物的克隆
(8)DNA序列測定
(9)真核重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建
(10)陽性重組質(zhì)粒的鑒定和篩選
(11)質(zhì)粒的大量提取
(12)轉(zhuǎn)染黑色素瘤細(xì)胞
第三部分：T-鈣粘蛋白基因的真核表達(dá)及生物活性分析
材料
方法
(1)轉(zhuǎn)染細(xì)胞的培養(yǎng)
(2) Western印跡法檢測轉(zhuǎn)染后蛋白的表達(dá)
(3)流式細(xì)胞周期分析
(4)凋亡的檢測
技術(shù)路線圖：
研究進(jìn)度安排：
學(xué)習(xí)學(xué)位課程，查閱文獻(xiàn)，完成課題設(shè)計
基本完成實驗研究工作
完成實驗補(bǔ)遺工作并 進(jìn)行統(tǒng)計分析，撰寫論文
論文答辯
經(jīng)費(fèi)預(yù)算
試劑費(fèi)用： 1500元《BR》組織及細(xì)胞： 100元
論文打印費(fèi)： 100元
答辯費(fèi)： 150元
總計： 19000元
課題可行性分析
已完成黑色素瘤及T-鈣粘蛋白研究最新進(jìn)展的文獻(xiàn)檢索和綜述報告工作。
所有實驗均在承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院皮膚病研究室和中心實驗室完成。實驗室的老師實驗技術(shù)熟練，在細(xì)胞培養(yǎng)、免疫組化及分子生物學(xué)等方面都可給予指導(dǎo);實驗所需的科研儀器設(shè)備實驗室均具備。
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日期:20XX年X月XX日
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